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BS-4401 雞胰蛋白酶(trypsin)ELISA試劑盒
本試劑盒僅供研究使用，不用于臨床診斷。
1. 簡介：
雞胰蛋白酶（Trypsin）是一種絲氨酸蛋白酶，在禽類消化和生理過程中起著關鍵作用。本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（Sandwich ELISA）定量檢測雞血清、血漿、細胞培養上清液或其他生物液體樣本中的胰蛋白酶濃度。
2. 實驗原理：
本實驗采用雙抗體夾心法。
將特異性抗雞Trypsin抗體預包被在微孔板上。
加入樣本和標準品，其中的Trypsin會與孔板上的捕獲抗體結合。
洗板后，加入生物素標記的檢測抗體，與Trypsin的另一位點結合，形成“抗體-抗原-抗體"復合物。
再次洗板后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素（Streptavidin），后者會與生物素特異性結合。
加入底物TMB顯色液，在HRP的催化下產生藍色產物，加入終止液后變為黃色。
用酶標儀在450 nm波長下測量各孔的吸光度（OD值），其顏色深淺與樣本中的Trypsin濃度成正比。通過繪制標準曲線，即可計算出樣本中Trypsin的實際濃度。
（注：請于收到試劑盒后核對各組分數量，并參照標簽說明進行保存。）
| 組分名稱 | 規格 (96T) | 保存條件 |
|---|---|---|
| 預包被微孔板 | 12條×8孔 | 2-8℃干燥保存 |
| 雞Trypsin標準品 | 凍干粉或液體 | -20℃保存（按說明書復溶或稀釋） |
| 樣本稀釋液 | 30 mL | 2-8℃保存 |
| 生物素標記檢測抗體 | 10-15 mL | 2-8℃保存（避免光照） |
| HRP標記的鏈霉親和素 | 10-15 mL | 2-8℃保存（避免光照） |
| 濃縮洗滌液 (20X) | 50 mL | 2-8℃保存（使用前需稀釋） |
| TMB底物溶液 | 10-15 mL | 2-8℃避光保存 |
| 終止液 (2M H?SO?) | 10-15 mL | 2-8℃保存 |
| 封板膜 | 4-6張 | 室溫 |
| 說明書 | 1份 | 室溫 |
酶標儀（450 nm濾光片）
精密移液器及一次性吸頭
渦旋混合器
37℃恒溫孵育箱
洗板機或手動洗板設備（多道移液器）
蒸餾水或去離子水
用于稀釋標準品和樣本的試管、EP管
吸水紙
平衡室溫：將所有試劑（除標準品外）取出，平衡至室溫（18-25℃）約30分鐘后再使用。
配制洗滌液：將濃縮洗滌液（20X） 用蒸餾水或去離子水按 1:19 稀釋，即1份濃縮洗滌液加19份水，混勻后即為工作濃度洗滌液。
配制標準品：
若標準品為凍干粉：加入指定體積的樣本稀釋液進行復溶，靜置片刻，輕輕渦旋混勻。此溶液為最高濃度標準品（Stock）。
若標準品為液體：直接進行系列稀釋。
按照說明書要求，用樣本稀釋液進行倍比稀釋，制備一系列不同濃度的標準品點（例如：1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 pg/mL）。通常設置7個標準品點和一個零點（樣本稀釋液作為空白孔）。
稀釋樣本：根據預實驗或文獻報道，用樣本稀釋液對未知樣本進行適當稀釋（如10倍、100倍稀釋）。建議初次實驗設置多個稀釋度，以確保OD值落在標準曲線線性范圍內。
總流程概要： 加樣 → 孵育 → 洗板 → 加檢測抗體 → 孵育 → 洗板 → 加酶結合物 → 孵育 → 洗板 → 顯色 → 終止 → 檢測
加樣：
設置標準品孔、樣本孔和空白孔（Blank）。
標準品孔：加入不同濃度的標準品100 μL。
樣本孔：加入已稀釋的待測樣本100 μL。
空白孔：加入樣本稀釋液100 μL。
注意：每個標準和樣本建議設2-3個復孔。
蓋上封板膜，在37℃下孵育90分鐘。
洗板：
小心揭掉封板膜，棄去孔內液體。
每孔加滿工作洗滌液（約350 μL），靜置30秒后棄去，如此重復洗板3次。
最后一次洗板后，在吸水紙上拍干，確保無液體殘留。
加檢測抗體：
除空白孔外，每孔加入生物素標記的檢測抗體100 μL。
蓋上新的封板膜，在37℃下孵育60分鐘。
洗板：
重復步驟2的洗板過程，共洗板3次。
加酶結合物：
每孔（包括空白孔）加入HRP標記的鏈霉親和素100 μL。
蓋上新的封板膜，在37℃下孵育30分鐘（避免光照）。
洗板：
重復步驟2的洗板過程，共洗板5次（此步需更凈，減少非特異性結合）。
顯色：
每孔（包括空白孔）加入TMB底物溶液90 μL。
蓋上封板膜，在37℃避光條件下顯色15-20分鐘。期間密切觀察標準品孔的顏色變化（出現梯度藍色）。
終止：
當最高濃度標準品孔呈現明顯的藍色，且梯度良好時，每孔加入終止液50 μL。溶液顏色立即由藍變黃。
檢測：
在加入終止液后15分鐘內，用酶標儀在450 nm波長下測量各孔的吸光度（OD值）。
設置：先用空白孔調零。
計算每個標準品和樣本復孔的平均OD值。
以標準品的濃度為橫坐標（X軸），對應的平均OD值為縱坐標（Y軸），在半對數坐標紙上或用軟件（如Excel，選擇四參數 logistic (4-PL) 曲線擬合）繪制標準曲線。
將樣本的平均OD值代入標準曲線方程，計算出對應的濃度（X值）。
重要：計算出的樣本濃度必須再乘以樣本的稀釋倍數，才能得到樣本中Trypsin的實際濃度。
安全第一：終止液為稀硫酸，具有腐蝕性，請佩戴手套和護目鏡操作。如不慎接觸皮膚，立即用大量清水沖洗。
試劑保存：未使用的板條應立即放回帶有干燥劑的鋁箔袋中密封，2-8℃保存。TMB和酶結合物對光敏感，需避光保存。
操作規范：精確的移液和的洗板是實驗成功的關鍵。避免交叉污染。
時效性：所有試劑應在有效期內使用。復溶后的標準品分裝凍存于-20℃，避免反復凍融。
線性范圍：如果樣本OD值超出標準曲線最高點，請增加稀釋倍數后重新檢測。
質量控制：建議每次實驗都運行標準曲線，并設置質控樣本。
注：以上資料僅供參考，不作為實際數據，如需其他請咨詢技術老師或品牌供應商。
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